Cas12 faolligini sozlanishi mumkin bo'lgan boshqarish universal va tez bir-pot nuklein kislotasini aniqlashga yordam beradi
Nashr qilgan: Xitoy Fan va Texnologiya Universiteti
Jurnal: Nature Communications
Ta'sir faktori: 14.7
MIRA texnologiyasidan foydalanib, geparin natriyga asoslangan universal bir{0}}pot floresan nuklein kislotani aniqlash usuli (SO'RVEY) ishlab chiqildi. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, natriy geparin Cas12a-crRNK bilan bog'lanish jarayoniga aralashib, Cas12a ajralish faolligini tartibga solishi mumkin. Natriy geparin kontsentratsiyasini sozlash orqali SURVEY ham klassik, ham suboptimal PAM ketma-ketligiga mos keladi va bir nechta Cas12 kichik turlariga qo'llaniladi. Aniqlash vaqti atigi 15-20 daqiqa boʻlgan bu usul maymunchechak psevdovirusi, gripp A virusi va SARS-CoV-2 ni aniqlashda sezgirlik va oʻziga xoslikka 95% dan oshadi. Bu arzon-va an'anaviy CRISPR diagnostikasida sezuvchanlik va o'ziga xoslik o'rtasidagi qiyin muvozanatni bartaraf etib, tibbiy soha diagnostikasi va atrof-muhit monitoringi uchun yangi, tibbiy yordam nuqtasini aniqlash usulini taqdim etadi.
1. Geparin natriyning ta'sir mexanizmini o'rganish
10nM maqsadli DNKni o'z ichiga olgan Cas12a{1}}crRNA tizimiga lyuminestsent prob qo'shildi va natriy geparin qo'shilmagan holda tez va sezilarli lyuminestsent signal kuzatildi. 0,2 ug/ml natriy geparin qo‘shilganda, lyuminestsent signal nazorat guruhinikiga o‘xshardi, bu esa natriy geparinning Cas12a. 0.2ug/ml natriy geparinning trans-bo‘linish faolligini sezilarli darajada inhibe qilganini ko‘rsatdi, bu minimal inhibitiv konsentratsiya hisoblanadi. Natriy geparin kontsentratsiyasi 0,2ug/ml dan 0,5ug/ml gacha oshishi bilan Cas12a ning cis{11}}ajralish faolligi asta-sekin inhibe qilinadi va 0,5ug/mlda esa trans{14}}ajralish faolligi deyarli butunlay inhibe qilinadi. Natriy geparinning ta'sir qilish mexanizmi bo'yicha tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, natriy geparinning manfiy zaryadlangan guruhlari crRNKning Cas12a bilan to'g'ri bog'lanishiga xalaqit beradi va crRNACas12a binar kompleksining shakllanishiga ta'sir qilishi mumkin.
- MIRA-Cas12a one-pot aniqlash
Natriy geparinning ta'sir qilish mexanizmini tasdiqlaganidan so'ng, maqola MIRA kuchaytirgichi va Cas12a vositachiligidagi floresansni aniqlashni bitta naychada birlashtirgan-potani aniqlash strategiyasini (MIRA-Cas12a) o'rgandi.
Natriy geparin bo'lmaganida, MIRA{0}}Cas12a kombinatsiyasi maqsadli gen kontsentratsiyasining 0,1aM dan 10fM oralig'ida muhim floresans signalini ishlab chiqarmadi. 40µg/ml natriy geparinda 1aM (≈0,6 nusxa/mkl, hajm=30mL) dan 10fM (≈6000 nusxa/mkl, hajm=30mL) gacha boʻlgan maqsadli konsentratsiya diapazonida sezilarli floresans signali kuzatildi, sezuvchanlik 0-0 barobarga koʻproq yaxshilandi. natriy geparinsiz tizim.
Maymunchechak virusi shablon kontsentratsiyasi 10 fM edi va Cas12a{2}}crRNK (100 nM) f31 va b6r maqsadli genlarini aniqlash uchun ishlatilgan. Amplifikatsiya reaktsiyasi 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 va 20 daqiqalarda tugatildi va turli vaqtlarda MIRA kuchaytiruvchi mahsulot tarkibi agaroz jellarida tahlil qilindi. Keyin olingan mahsulotlar agaroz jellarida uch xil sozlamalar ostida tahlil qilindi: MIRA-Cas12asiz geparin natriy, MIRA{18}}Geparin natriysiz MIRA-Cas12a va geparin natriyli MIRA-Cas12a. Natijalar shuni ko'rsatdiki, geparin natriy yo'q bo'lganda, Cas12a ning yuqori cis{23}}bo'linish faolligi tufayli nuklein kislotaning kuchayishiga to'sqinlik qilgan. Biroq, geparin natriy qo'shilishi Cas12a ning cis{27}}ajralish faolligining pasayishi hisobiga nuklein kislotaning kuchayishini sezilarli darajada oshirdi.
Maqolada klassik PAM va suboptimal PAM ketma-ketliklari yordamida natriy geparinga asoslangan universal yagona{0}}pot floresan nuklein kislotasini aniqlash usuliga (SO‘RVEY) erishish mumkinligi ko‘rsatilgan. Bundan tashqari, LbCas12a dan tashqari, CRISPR-Dx usullarida AsCas12a va AapCas12b ham keng qo'llaniladi. MIRA-AsCas12a ishlatadigan tizimda floresansiya faqat 40ug/ml natriy geparin borligida kuzatildi, bu f31 va b6r genlarining 1fMini aniqlay olishini ko'rsatdi. Natriy geparin bo'lmasa, MIRA-AapCas12b 1 f31 va b6r genini aniqlay oladi. 20ug/ml natriy geparinni kiritish nafaqat MIRA-AapCas12b ni aniqlash tezligini tezlashtirdi, balki floresans intensivligini ham oshirdi. Bu topilmalar shuni ko'rsatadiki, geparin natriy dozasidan foydalangan holda ishlab chiqilgan bitta idish usuli boshqa Cas12 kichik turlari uchun ham qo'llanilishi mumkin.
